第５・６回　「遺伝子の内容を読んだり書き換えることができる」の記録１（遺伝子組み換え実験）

培地の準備をしています。寒天培地は三種類作ります。LB培地（今回の実験に使う大腸菌K12株が生育しやすいもの）とアンピシリン（抗生物質大腸菌を殺してしまう）を加えたものとアンピシリンリンとアラビノース（糖の一種）を加えたものです。これらの準備は数日前に行っておきます。

DNAの構造について講義をしています。左上

昨日から培養してある大腸菌のコロニーをループでとり形質転換溶液の入れてあるチューブに入れます。培養開始から24時間後が最も大腸菌の活性が高く遺伝子組み換えに適しています。さらに、組み込む遺伝子の入ったプラスミドを加え氷冷します。

形質転換溶液（塩化カルシウム水溶液）は大腸菌の細胞膜の性質を変化させプラスミドを取り込みやすくします。

操作は無菌的に行う必要があります。机上をエタノールで消毒しアルコールランプが作る上昇気流中で操作をします。

ヒートショックを与えたチューブを直ぐに氷冷します。ヒートショックを与えた大腸菌は不安定な状態です。すぐ氷冷しないと失敗します。これで、目的の遺伝子が組み込まれたはずです。

可視光線で見た結果です。

組み込んだプラスミドには
�@GFP（紫外線を当てると緑色の蛍光を発するタンパク質）の遺伝子
�Aアンピシリン耐性遺伝子（アンピシリンを分解しアンピシリンで死ななくなる）
�BアラビノースがあるときだけGFPの遺伝子を働かせる遺伝子スイッチ
があらかじめ組み込んであります。

コロニーは一個の菌が増殖したものです。したがってコロニーの数はもともとの菌の数を示しています。

�CLB培地に組み換えをしていない菌を植えたものでは多数の菌が生育しました（数が多すぎてコロニーの数を数えることは出来ません）

�Bアンピシリンを培地に加えたものでは組み換えをしていない菌は全く生育できませんでした。

�A�@アンピシリンを加えた培地で組み換えた菌は生育しています。�Cと比べコロニーが少ないのは組み換えに失敗したものがあるためと考えられます。�Aと�@のアラビノースの有無による違いはここでは認められません。

＊上の写真は予備実験の時のものです。下の写真のものと同じものではありません。

GFPの発する蛍光は時間とともに強くなります。左の写真はほぼ２４時間後のものです。非常にきれいです。

このGFPの遺伝子は働いているかいないかがすぐにわかるために、働いているのかどうかを知りたい遺伝子のすぐ近くに組み込み、目的の遺伝子が働いているのかどうかを知るための目印（マーカー）として広く使われています。

また、アラビノースなどによって特定の遺伝子のスイッチが入る仕組みはオペロンと呼ばれ、もっともよく知られた遺伝子スイッチの例です。

詳細は、テキストを見てください。

形質転換効率を求める（おまけです）

講座では省略しましたが形質転換効率の計算もできます。実際にこの実験で遺伝子の組み換えに成功する割合はどのぐらいでしょうか。予備実験の時に行った実験を紹介します。　

�Aまたは�@のアンピシリンを加えた培地では組み換えに失敗した菌はアンピシリンに耐性を持たないので死んでしまいます。それに対して�Cの培地にはアンピシリンが加えられていないのですべての菌が生育しているはずです。

�Aまたは�@コロニーの数と�Cのコロニーの数を数え�A／�Cで組み換えに成功する割合が求められるはずです。

しかし�Cでは多数の菌が生育しているためコロニーを数えることが出来ません。そこで�Cにまいた菌の溶液を形質転換溶液で１０倍、１００倍・・・と希釈してそれぞれ別の培地にまき同じ条件で培養します。上の写真では１０００倍希釈したもので４００程度のコロニーを数えることが出来ます。１０００倍希釈で４００ということは元は４００×１０００＝４０００００ということになります。

�Aの培地では４００程度のコロニーを数えられるので、組み換えに成功する割合は４００／４０００００＝１／１０００つまり約０．１％です。

安全に実験を行うために

実験の前後、実験台や手はエタノールで消毒します。

大腸菌や大腸菌をあつかったピペットチップやループ（大腸菌を培地にまくときに使う）はオートクレーブで高圧蒸気滅菌（１２０℃２０分）します。左の写真。

大腸菌K12株は無害でしかもLB培地中でないと生育が困難です。

ベクターとして用いたプラスミドは感染性がないもので他の菌に取り込まれることはありません。

組み込んだ遺伝子GFP遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、アラビノースによる遺伝子スイッチの遺伝子は害のないものです。

以上文部科学省の「教育目的組換えDNA実験指針」に従って実験を行いました。